Планер Me.321 проектировался специально для использования в операции "Морской лев" - высадка десанта в Великобритании. Отмена операции заставила задуматься об использовании планера в качестве транспортного, но он оказался малопригодным для использования в этой роли. Его внушительные размеры требовали применения очень рискованного метода буксировки "Тройка-шлепп", из-за чего полеты могли проходить только днем и в хороших погодных условиях. Для взлета использовались стартовые ракеты. Поэтому компании Messerschmitt было предложено рассмотреть возможность установки на планер двигательной установки, позволявшей поддерживать после взлета на буксире горизонтальный полет, или даже взлетать с полным весом. Согласно этому заданию были оборудованы два опытных самолета: Me.321C с четырьмя моторами Gnome-Rhone 14N, что требовало для взлета с полным весом использования тройки-шлепп, и Me.321D с шестью францускими двигателями, которых было достаточно для превращения планера в обычный транспортный самолет. Позже доработанные планеры получили новое обозначение Me.323.

В целом конструкция планера была сохранена. Лонжерон центроплана был усилен для крепления двигателей, экипаж был дополнен двумя бортинженерами, кабины для которых были оборудованы в передней кромке крыла между двигателями. В крыле были установлены шесть протектированных баков. По бортам фюзеляжа в коробчатом обтекателе установили шасси с 10 колесами, которые обеспечивали низкое давление на грунт и ровное положение самолета при любой нагрузке.

Летные испытания обоих машин начались в марте 1942 года. Хотя выяснилось, что самолет требует от пилота особого внимания на взлете и посадке, управляемость в воздухе оказалась приемлемой. Из-за необходимости буксировки на взлете, от разработки Me.323C отказались, а Me.323D был запущен в серию.

Серийные самолеты имели меньшее число иллюминаторов, сдвинутый назад хвостовой костыль. Кроме двух стрелковых установок в верхней части створок люка, за крылом сверху были установлены еще два 7,9-мм пулемета MG-17. Кроме того, в иллюминаторах можно было установить шесть пехотных MG-34. Под крылом можно было подвесить те же стартовые ракеты, что и на Me.321. Дальность полета с нагрузкой 10т составляла 1000км.

В ноябре 1942 года самолеты Me.323D начали полеты на средиземноморском театре, перевозя зенитные и противотанковые орудия, боеприпасы и топливо для Африканского корпуса. В обратную сторону они везли раненных и пустые бочки. Самолеты использовались только днем из-за отсутствия необходимого приборного оборудования, но потери были относительно невелики. Hесмотря на близость Мальты, воздушный мост через Средиземное море в то время редко подвергался атакам истребителей.

К концу 1943 года истребители союзников резко активизировались, что заставило увеличить прикрытие транспортных самолетов и усилить их оборонительное вооружение. Пулеметы MG-15 в носу и на фюзеляже были заменены на 13-мм MG-131. В створках носового люка были прорезаны порты еще для двух пулеметов, увеличив количество стволов, направленных вперед, до четырех. На некоторых самолетах устанавливалась еще одна верхняя стрелковая установка с двумя MG-15.

С самого начала эксплуатация Ме.323 была очень успешной. Идея загрузки-разгрузки через носовой люк была очень удачной. Стартовые ракеты использовались редко из-за низкой надежности, а при посадке мог использовать специальный тормозной крюк в задней части фюзеляжа. В воздухе самолет мог держаться даже при очень больших дырах в обшивке. К тому же Ме.323 был очень простым в производстве. Однако темпы производства были невысоки, а потери так велики, что к апрелю 1943 года почти все самолеты Me.323 были уничтожены на земле или в воздухе.

Тем временем по опыту боевого использования была разработана еще одна модификация самолета Me.323E. Он получил усиленную конструкцию, увеличенный запас топлива, новое оборонительное вооружение. Блистеры на верхней части створок носового люка были сняты. Вместо них установили установки с пулеметами MG-131. Такие же пулеметы поставили по бокам фюзеляжа. На крыло за кабинами бортинженеров установили две башни с 20-мм пушкой MG-151 в каждой. Хотя оборонительное вооружение постоянно усиливали, нижняя полусфера так и осталась неприкрытой.

Несмотря на небольшое количество этих транспортных самолетов, они действовали на всех участках от Риги до Севастополя. Доводка базовой конструкции продолжалась до весны 1944 года. Были разработаны варианты Me.323F с двигателями Jumo-211R мощностью 1480л.с. и Me.323G с моторами Gnome-Rhоne 14R мощностью 1320л.с. Предполагалось использовать самолет в качестве носителя опытной бомбы весом 17,7т.

Производство Me.323 окончательно остановилось в апреле 1944 года. Всего было построено 198 самолетов этого типа. Этот самолет можно считать первым в мире специализированным военно-транспортным самолётом. На нём были реализованы такие передовые для своего времени решения, как широкий фюзеляж, большой передний грузолюк, трансформируемая грузовая кабина, многоколёсное шасси.